HPLC液相常見(jiàn)問(wèn)題回答（下篇）

19.除了流速外，還有哪些因素能引起壓力改變？

改變流動(dòng)相組成和溫度；改變柱長(zhǎng)、柱內(nèi)徑和填料粒度；柱突然阻塞壓力升高（正常情況下其它條件不變柱壓都是逐漸升高的）。

20.什么是強(qiáng)溶劑、弱溶劑？

改變流動(dòng)相的組成或溶劑溶劑強(qiáng)度就可以改變峰容量因子和保留時(shí)間。在一定條件下，減少保留時(shí)間或縮短分析時(shí)間的溶劑為強(qiáng)溶劑，增加保留時(shí)間或延長(zhǎng)分析時(shí)間的溶劑為弱溶劑。

21.怎樣才會(huì)使峰位發(fā)生重排？

在分析多組分樣品時(shí)，僅改變流動(dòng)相的強(qiáng)度（組成百分比）而不改變其組成，一般僅僅改變所有組分的保留時(shí)間，不會(huì)發(fā)生峰位的重排。下列條件改變可能發(fā)生峰位重排：流動(dòng)相中換了強(qiáng)溶劑；PH值的改變；柱填料的改變；柱溫的改變；流動(dòng)相的組成改變（如加入離子對(duì)試劑三乙基胺等）。

22.除了在線脫氣，常用的實(shí)驗(yàn)室脫氣方式還有哪些？

加熱回流脫氣，脫氣效果最佳，但無(wú)法保持；氦脫氣，此方法脫氣效果佳，能除去百分之九十以上的空氣，但氦氣價(jià)格太貴，所以用的不多；真空脫氣，效果僅次于氦脫氣，但脫氣過(guò)程中容易造成樣品溶液揮發(fā)損失；超聲脫氣，只能脫去約百分之三十的空氣，但在實(shí)驗(yàn)室中最常用。目前還是盡量爭(zhēng)取用在線脫氣，方便且效果好。

23.評(píng)價(jià)一個(gè)色譜柱的最基本指標(biāo)有那些？

評(píng)介一根色譜柱的基本指標(biāo)是：塔板數(shù)、峰不對(duì)稱因子、柱壓降、適用范圍和鍵合相濃度以及峰容量。

24.什么是色譜的時(shí)間常數(shù)？

時(shí)間常數(shù)實(shí)際上是響應(yīng)時(shí)間的設(shè)定，起著過(guò)濾噪音的作用。時(shí)間常數(shù)太?。ㄌ欤┛赡茉黾佣淘胍?，時(shí)間常數(shù)太大（太慢）可能出寬峰、拖尾峰。

25.為什么在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中有時(shí)會(huì)出現(xiàn)倒峰？

所用的流動(dòng)相在檢測(cè)波長(zhǎng)下有吸收，而進(jìn)在此波長(zhǎng)下沒(méi)有吸收或吸收低于流動(dòng)相的溶液，在流動(dòng)相中會(huì)出現(xiàn)洞穴，通過(guò)柱后出現(xiàn)倒峰。

26.為何會(huì)出現(xiàn)“胖"峰和平頭峰？怎樣避免？

用比流動(dòng)相強(qiáng)度大的大體積樣品進(jìn)樣，通常會(huì)損害色譜圖的質(zhì)量，而出現(xiàn)“胖"峰和平頭峰。應(yīng)遵循下列規(guī)則選用溶劑溶解樣品：A最好用流動(dòng)相溶解樣品進(jìn)樣。B用大體積弱溶劑溶解樣品，如反相色譜中用水溶解樣品進(jìn)樣，主要缺點(diǎn)是每次進(jìn)樣后在色譜圖的開(kāi)頭出現(xiàn)大的負(fù)峰，有時(shí)還波及到樣品峰。C需要時(shí)用強(qiáng)溶劑溶解進(jìn)樣。

27.什么是次級(jí)保留效應(yīng)？

在良好的色譜分離中，樣品分子是以單一的保留過(guò)程被保留。如在反相色譜中，溶質(zhì)與柱填料的非極性烷基鏈發(fā)生疏水性相互作用。但在以硅膠為基質(zhì)的填料中，有些樣品組分能與硅醇基團(tuán)相互作用，脫附的過(guò)程很慢，使峰嚴(yán)重拖尾，這就是次保留過(guò)程。對(duì)付次保留效應(yīng)最有效的方法就是選用封尾更好色譜柱或加入流動(dòng)相改良劑（也叫掃尾劑）。

28.前延峰的發(fā)生及處理？

因柱溫問(wèn)題很易引起前延峰，有些樣品在常溫下分離可見(jiàn)前延峰，提高溫度后前延峰的現(xiàn)象消失。在離子對(duì)色譜中，前延峰的另一個(gè)原因是用非流動(dòng)相作樣品溶劑。因此在離子對(duì)色譜中要求僅用流動(dòng)相溶解樣品，而且進(jìn)樣量不要太大，否則會(huì)導(dǎo)致前延峰或其它問(wèn)題。在RP-HPLC中樣品溶液的強(qiáng)度大于流動(dòng)相引起前延峰。增加流動(dòng)相的強(qiáng)度，減少樣品溶液的強(qiáng)度，在離子對(duì)色譜中增加離子強(qiáng)度，可以克服前延峰的效應(yīng)。此外使用流動(dòng)相溶解樣品是解決的最簡(jiǎn)單實(shí)用的方法。

29.峰變寬的原因？

A在使用過(guò)程中柱本身退化，逐漸降低柱效。B柱外峰寬效應(yīng)。一根很好的專用柱用于另一液相色譜系統(tǒng)引起塔板數(shù)降低，說(shuō)明新系統(tǒng)有很大的柱外峰寬效應(yīng)。C化學(xué)效應(yīng)，多數(shù)是流動(dòng)相和固定相相互作用所致，改變流動(dòng)相可使寬峰有所改善。

30.柱平衡慢的常見(jiàn)原因有哪些？

柱平衡慢的常見(jiàn)原因是，組分在舊的或新的流動(dòng)相中對(duì)柱吸附強(qiáng)，或者在新的流動(dòng)相中濃度小甚至為零。A流動(dòng)相含有胺改良劑；B流動(dòng)相含有離子對(duì)試劑；硅膠柱；流動(dòng)相中有四氫呋喃。可考慮采用專用柱用于特殊的方法，不用時(shí)將柱折下來(lái)，注滿適當(dāng)?shù)娜軇┗蛄鲃?dòng)相，密封保管，不再作其它的分析。

31.用內(nèi)標(biāo)法實(shí)驗(yàn)時(shí)對(duì)內(nèi)標(biāo)物的要求有哪些？

A內(nèi)標(biāo)物的結(jié)構(gòu)或理化性質(zhì)應(yīng)與被分析組分相似或相近；B內(nèi)標(biāo)物的保留值應(yīng)稍大于或小于被分析物的保留，不能相差過(guò)大；C內(nèi)標(biāo)物的峰要與所有被分析物的峰有良好的分離度（R大于1.5），不能讓內(nèi)標(biāo)物成了干擾物；D無(wú)結(jié)構(gòu)相似的內(nèi)標(biāo)物，可用保留相近的內(nèi)標(biāo)物；E儀器對(duì)分析物的響應(yīng)與內(nèi)標(biāo)基本一致，出峰面積大小不能相差懸殊。

32.管子切割與安裝注意事項(xiàng)？

A管子的斷面必須垂直，否則，將會(huì)產(chǎn)生死體積而引起色譜峰峰形擴(kuò)展。B確保管子內(nèi)表面不被損傷，如果損傷，可能會(huì)發(fā)生管路堵塞。C將管子完全插入開(kāi)口端，直至其與開(kāi)口端的末端相碰為止。否則，將會(huì)產(chǎn)生死體積而引起色譜峰峰形擴(kuò)展。D不要過(guò)分?jǐn)Q緊螺帽，以防損壞螺紋。

33. 什么是HPLC的“無(wú)限直徑效應(yīng)"？

在HPLC分析中由于使用了高效微粒固定相及高壓流動(dòng)相，樣品以柱塞式注入色譜柱后，因柱的阻力大，樣品分子在柱中的分子擴(kuò)散很小，直至它從色譜柱流出也未與色譜柱內(nèi)壁接觸，因而引起的色譜峰形擴(kuò)展很小，能保持高柱效。

34.如何評(píng)價(jià)一臺(tái)檢測(cè)器？

A噪聲：通常噪聲是指由儀器的電氣元件、溫度波動(dòng)、電壓的線性脈沖以及其他非溶質(zhì)作用產(chǎn)生的高頻噪聲和基線的無(wú)規(guī)則波動(dòng)；

B基線飄移：漂移是基線的一種向上或向下的緩慢移動(dòng)，可在較長(zhǎng)時(shí)間（0.5~1h）內(nèi)觀察到。它可掩蔽噪聲和小峰。漂移與整個(gè)液相色譜系統(tǒng)有關(guān)，而不僅是由檢測(cè)器引起的；

C靈敏度（最小檢出濃度或最小檢出量）：在一個(gè)特定分離工作中， 檢測(cè)器是否有足夠的靈敏度是十分重要的。當(dāng)比較檢測(cè)器時(shí)，常使用敏感度這一性能指標(biāo)。敏感度即指信號(hào)與噪聲的比值（信噪比）等于2時(shí)，在單位時(shí)間內(nèi)進(jìn)入檢測(cè)器的溶質(zhì)的濃度或質(zhì)量；

D線性范圍：在進(jìn)行定量分析時(shí)，希望檢測(cè)器有寬的線性范圍，以便在一次分析中可同時(shí)對(duì)主要組分和痕量組分同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)；

E檢測(cè)器的池體積：它應(yīng)小于最早流出的死時(shí)間色譜峰的洗脫體積的1/10，否則會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的柱外譜帶擴(kuò)展。

35.如何簡(jiǎn)單判斷比例閥是否內(nèi)漏？

設(shè)定泵使用一個(gè)單獨(dú)通路（A），打開(kāi)Purge閥，流速5ml/min，提起其他溶劑瓶?jī)?nèi)的溶劑過(guò)濾頭直至離開(kāi)液面，觀察這些通路（B、C、D）內(nèi)的溶劑是否隨著流動(dòng)，正常時(shí)均不應(yīng)流動(dòng)。

36、色譜峰面積與已知濃度溶液的成分不成比例

可能原因：36.1保留時(shí)間出現(xiàn)錯(cuò)位，影響因素：室內(nèi)溫度25左右，溫度波動(dòng)大；流動(dòng)相比例必須嚴(yán)格精密配置，醋酸增加會(huì)影響流動(dòng)相的PH值；

37、流動(dòng)相中不同成分對(duì)峰形、分離度的影響

對(duì)于反向色譜法，一般為非極性固定相c18和C8， 流動(dòng)相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫富喃等與水互溶的有機(jī)溶劑用于調(diào)整保留時(shí)間，為控制樣品在流動(dòng)相中的解離，常用緩沖液（冰醋酸）控制流動(dòng)相的PH值，c18和C8的PH值多控制在2.5-7.5之間。冰醋酸可調(diào)整流動(dòng)相PH值，另外可減少峰形脫尾。增加分離度可適量減少甲醇。